روش انجام آزمایش نئوبیوسین-آزمایش نئوبیوسین

مقدمه‌ای بر تست حساسیت نووبیوسین

نووبیوسین یک آنتی‌بیوتیک آمینوکومارین است که توسط اکتینومیست Streptomyces nivens تولید می‌شود و دارای خاصیت ضد باکتریایی است. در سال ۱۹۷۵، کلوس و شلیفر طرح ساده شده‌ای را برای افتراق گونه‌های استافیلوکوک کواگولاز منفی گزارش کردند که شامل آزمایش دیسک نووبیوسین بود.

استافیلوکوک ساپروفیتیکوس، یک استافیلوکوک کواگولاز گرم مثبت و یک باکتری اوروپاتوژن است که باعث عفونت حاد بدون عارضه دستگاه ادراری، به ویژه در بیماران زن جوان و میان‌سال می‌شود. ساپروفیتیکوس بر خلاف بسیاری از موارد منفی دیگر، به ندرت به اکثر آنتی‌بیوتیک‌های فعال در برابر ارگانیسم‌های گرم مثبت مقاوم است. S. saprophyticus  به طور ذاتی به آنتی‌بیوتیک نووبیوسین مقاوم است.

بنابراین، غربالگری استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی از کشت‌های ادرار برای مقاومت به نووبیوسین یک روش شناسایی احتمالی قابل اعتماد ساپروفیتیکوس است.

هدف از تست حساسیت نووبیوسین

تعیین الگوی حساسیت باکتری به آنتی‌بیوتیک نووبیوسین.

اساس تست حساسیت نووبیوسین

نووبیوسین یک آنتی‌بیوتیک است که در بازکردن و بسته بندی مجدد DNA در حین تکثیر DNA و چرخه سلولی باکتری دخالت می‌کند. نووبیوسین به DNA گیراز متصل می‌شود و فعالیت آدنوزین تری فسفاتاز (ATPase) را مسدود می‌کند.

حساسیت به نووبیوسین با قرار دادن یک دیسک کاغذی آغشته به نووبیوسین بر روی صفحه آگاری که حاوی ارگانیسم مورد بررسی است، تعیین می‌شود. با تکثیر ارگانیسم در طول انکوباسیون با رشد هم‌آهنگ، سلول‌ها در معرض آنتی‌بیوتیکی قرار می‌گیرند که از دیسک کاغذی به داخل آگار منتشر می‌شود. اگر باکتری‌ها نسبت به نووبیوسین حساس باشند، ناحیه مهار قابل‌مشاهده‌ای در اطراف دیسک ایجاد می‌شود که نشان دهنده ناحیه‌ای است که غلظت آنتی‌بیوتیک از رشد باکتری جلوگیری کرده است. عدم وجود منطقه مهاری در اطراف دیسک نشان می‌دهد که ارگانیسم در برابر آنتی‌بیوتیک مقاوم است.

از این رو، در آزمایشگاه، یک پلیت مولر – هینتون آگار شدیداً با ارگانیسم مورد آزمایش، کشت داده می‌شود تا یک رشد هم‌جوار روی سطح آگار ایجاد شود. پس از کشت، یک دیسک آنتی‌بیوتیک نووبیوسین بر روی سطح آگار قرار داده می‌شود. پس از انکوباسیون، حساسیت ارگانیسم به آنتی‌بیوتیک با روش کربی بائر تعیین می‌شود.

دیسک نووبیوسین:

دیسک با آغشته کردن ۵ گرم نووبیوسین بر روی دیسک‌های کاغذ صافی با قطر ۶ میلی متر با کیفیت بالا (که در بازار موجود است) تهیه می‌شود.

روش تست حساسیت نووبیوسین

1. تست باید ۱۸-۷۲ ساعت ایزوله و در کشت خالص باشد. سوسپانسیون ایزوله آزمایشی را در براث سویا تریپتیک برابر با استاندارد مک فارلند ۰٫۵ یا معادل آن تهیه کنید.
2. یک سواب استریل را در سوسپانسیون فرو کنید و آن را به سمت لوله بالاتر از سطح مایع بچرخانید تا تلقیح اضافی حذف شود.
3. با استفاده از سواب، یک بلاد آگار یا پلیت مولر هینتون آگار را با کشیدن سواب روی تمام سطح آگار تلقیح کنید و این کار را در ۲ صفحه تکرار کنید.
4. اجازه دهید سطح آگار بیش از ۱۵ دقیقه قبل از استفاده از دیسک نووبیوسین خشک شود. با یک سواب استریل، با کشیدن سواب روی کل صفحه در ۳ جهت و در اطراف لبه صفحه، یک محیط رشد را روی کل صفحه آماده کنید.
5. با استفاده از فورسپس آغشته شده به الکل و شعله، یک دیسک آنتی‌بیوتیک نووبیوسین را به صورت آسپتیک روی سطح هر صفحه تلقیح شده قرار دهید. به آرامی دیسک‌ها را با پنس استریل فشار دهید تا مطمئن شوید که به سطح آگار می‌چسبند.
6. پلیت را به صورت هوازی به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
7. قطر ناحیه مهار را با استفاده از کولیس‌های کشویی یا خط کش متریک اندازه گیری کنید.

نتایج مورد انتظار

مثبت – ناحیه مهار شده بیشتر از ۱۶ میلی متر نشان می‌دهد که ارگانیسم به آنتی‌بیوتیک حساس است.

منفی – ناحیه مهار کمتر یا مساوی ۱۶ میلی متر نشان دهنده مقاومت به نووبیوسین است.

کاربردهای تست حساسیت نووبیوسین

• استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی (CoNS) بر اساس الگوی حساسیت به نووبیوسین به دو گروه تقسیم شده‌اند. گروه CoNS که حساسیت به نووبیوسین را نشان می‌دهد شامل اپیدرمیدیس، capitis، S. haemolyticus، S. hominis subsp. hominis، S. lugdunensis، S. saccharolyticus، S. warneri و گونه‌های دیگر هستند.
• گروه مقاوم به نووبیوسین از گونه‌هایی مانند cohnii، kloosii، S. saprophyticus و S. xylosus تشکیل شده است.
• برای تشخیص احتمالی استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس از سایر استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی در نمونه‌های بالینی مفید است.

محدودیت‌های تست حساسیت نووبیوسین

• آزمایش باید بر روی کلنی‌های جدا شده از کوکسی‌های گرم مثبت هوازی، کاتالاز مثبت و کواگولاز منفی انجام شود.
• توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایشات بیوشیمیایی، ایمونولوژیکی، مولکولی یا طیف سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
• دیسک نووبیوسین چندان مفید نیست و اگر بر روی ایزوله‌هایی غیر از نمونه‌های ادراری انجام شود، می‌تواند باعث ایجاد نتایج گمراه‌کننده‌ای شود.
• گونه‌های انسانی مجزا که شامل saprophyticus، S. cohnii subsp یا S. xylosis نیستند نیز گاها ممکن است به نووبیوسین مقاوم باشند.