شمارش رتیکولوسیت (Reticulocyte count)
رتیکولوسیت ها، گلبول های قرمز بدون هسته و نارسی بوده که دارای اسید ریبونوکلئیک (RNA) می باشند. (nRBC) در مرحله اورتوکرومیک با بیرون راندن هسته به رتیکولوسیت تبدیل می شود. این سلول ها در شرایط طبیعی، ۳-۲ روز در مغزاستخوان باقی مانده، یک روز هم در جریان خون هستند و پس از آن به گلبول قرمز بالغ تبدیلمی شوند.
بقایای RNA سیتوپلاسمی و ارگانل هایی مانند ریبوزوم و میتوکندری در رتیکولوسیت دیده می شود. حدود ۲۰% هموگلوبین در این مرحله سنتز می شود. از شمارش رتیکولوسیت ها برای تعیین فعالیت سنتز گلبول های قرمز در مغز استخوان استفاده می شود و بنابراین شمارش آنها تخمینی خواهد بود از سرعت تولید گلبول های قرمز و نه تخریب آن ها.
شمارش مطلق رتیکولوسیت ها (Absolute Reticulocyte Count (ARC))
تعداد رتیکولوسیت ها در یک لیتر خون کامل را شمارش مطلق رتیکولوسیت می گویند.
میزان طبیعی رتیکولوسیت در بزرگسالان ۱.۵ – ۰.۵ % بوده و بنابراین شمارش مطلق طبیعی در بزرگسالان ۷۵-۲۵، میزان رتیکولوسیت در نوزادان شیرخوار ۶.۵ – ۲.۵ % بوده که تا اواخر هفته دوم زندگی، تا دامنه مرجع بزرگسالان، افت می کند. (واحد ۱۰ به توان ۹ بر لیتر)
اندکس تولید روزانه رتیکولوسیت (Reticulocyte Production Index (RPI))
رتیکولوسیت هایی که بصورت نارس از مغز استخوان به خون محیطی واردمی شوند، به عنوان رتیکولوسیت های تحت استرس (Shift Reticulocyte) شناختهمی شوند. رتیکولوسیت های تحت استرس، بجای اینکه در مدت ۱ روز در خون محیطی رشته های خود را از دست بدهند، این کار را در مدت ۴-۲ روز انجام می دهند، زیرا که زودتر از موعد مقرر وارد خون شده اند.
چنانچه در لام خون محیطی بیمار، سلول های پلی کرومازی یا گلبول های قرمز هسته دار در پاسخ به کمخونی شدید یافت شود، بایستی برای ارزیابی فعالیت روزانه مغزاستخوان فرد بیمار نسبت به شخص سالم، از اندکس RPI استفاده شود.
هنگامی که رتیکولوسیت بسیار نارس (آکنده از رشته های ریبوزم و ریبونوکلئیک اسید) بر اثر تحریک هورمونی از مغز استخوان وارد خون محیطی می شود، نسبت به حالت نرمال به زمان زیادتری برای بالغ شدن نیاز دارد. زمان بلوغ برای فردی با هماتوکریت ، %۴۵ یک روز است و هر ۱۰% که از میزان هماتوکریت کم شود، نصف روز به زمان بلوغ (Maturation Time (MT)) اضافه می شود:
| %HCT | ۴۰-۴۵ | ۳۵-۳۹ | ۲۵-۳۴ | ۱۵-۲۴ | <15 |
| Maturation Time | ۱.۰ | ۱.۵ | ۲.۰ | ۲.۵ | ۳.۰ |
جدول چهار: زمان بلوغ رتیکولوسیت در آزمایش CBC به روش دستی
با توجه به جدول بالا، شاخص تولید رتیکولوسیت از طریق فرمول زیر محاسبه می شود:
RPI= %Retic [(Patient)*HCT(Patient)]/[HCT(normal)*MT]
مثال: چنانچه درصد شمارش رتیکولوسیت فردی، ۷.۸% و هماتوکریت وی ۳۰% باشد:
RPI= (7.8 × ۳۰) / (۴۵ × ۲) = ۲.۶
عدد بدست آمده بدین مفهوم است که مغز استخوان این بیمار، ۲.۶ برابر فرد نرمال فعالیت اریتروپوئز دارد.
از آنجایی که تعداد کمی از رتیکولوسیت های واقعی شمارشمی شوند، خطای نمونه برداری در شمارش دستی رتیکولوسیت ها تا اندازه ای زیاد است. حدود اطمینان ۹۵% برای شمارش، به شکل زیر بیان شود:
که در اینجا ،Rشمارش رتیکولوسیت به درصد و Nتعداد گلبول های قرمز مورد ارزیابی است.
این بدین معنی است که چنانچه تنها ۱۰۰۰ گلبول قرمز شمارش شوند، حدود اطمینان برای شمارش رتیکولوسیت %۱ در محدوده، ۱.۶ – ۰.۴ % برای رتیکولوسیت %۵ در محدوده، ۴.۶ – ۳.۶ % و برای شمارش رتیکولوسیت ۱۰% در محدوده ۱۱.۹ – ۸.۱ %می باشد.
نکات مهم در رنگ آمیزی و شمارش رتیکولوسیت
- نمونه خون بایستی تازه باشد و حداکثر ۸-۶ ساعت از نمونه گیری آن در دمای اتاق گذشته باشد. زیرا با گذشت زمان رتیکولوسیت ها ممکن است به RBC تبدیل شوند. ICSH توصیه می کند که تعیین میزان رتیکولوسیت بلافاصله پس از نمونه گیری صورت بگیرد.
- خون بیمار بایستی هموژن بوده و به خوبی مخلوط شود تا رتیکولوسیت ها در نمونه خون بصورت یکنواخت و مناسب پخش شوند. بعد از رنگ آمیزی و انکوباسیون و قبل از تهیه گستره نیز نمونه خون بایستی به خوبی مخلوط شود.
- رنگ آمیزی رتیکولوسیت نیازی به فیکساسیون ندارد.
- خشک شدن سریع گستره رنگ شده برای بهبود وضوح تصویر سلول ها توصیه می شود. خشک شدن آهسته و ضعیف گستره و وجود رطوبت در لام، باعث ایجاد آرتیفکت های رفلکس دار و براق (مشابه واکوئل) در سطح سلول ها می شود که گاهی به علت شباهت به رتیکولوم های رسوب کرده در سلول، به عنوان رتیکولوسیت شمارش می شوند.
- به چنین سلول هایی که در اثر رطوبت ایجاد می شوند، Torocyte گفته می شود.
- در صورت کار کردن با پیچ میکرو در میکروسکوپ، بدلیل براق بودنشان به راحتی از رتیکولوسیت ها قابل تفکیک هستند.
- در نمونه های آنمیک بجای برداشت ۱۰۰µ خون، از حجم ۱۵۰µ و در نمونه های پلی سایتمیک از حجم ۵۰µ استفاده می شود.
- انکوباسیون طولانی تر از مقدار استاندارد، باعث رسوب غیراختصاصی رنگ بر روی RBCها شده و به اشتباه رتیکولوسیت شمارش می شوند.
- رنگ آمیزی با نیومتیلن بلو گرانول های آبی پررنگ تر و هموژن تری را در مقایسه با بریلیانت کرزیل بلو و ایجاد می کند و بنابراین از اولویت بالاتری برخوردارمی باشد.
- رتیکولوسیت ها را بایستی از اجسام پاپن هایمر، هاینز بادی، هاول ژولی و گلف بال های آلفاتالاسمی افتراق داد.