آزمایش اکسیداز برای بررسی وجود یک سیستم سیتوکروم اکسیداز استفاده می شود که انتقال الکترون بین دهنده ی الکترون در باکتری ها و یک رنگ رودکس
(tetramethyl-p-phenylene-diamine) را تسهیل می کند. و این معرف به رنگ بنفش تیره تغییر رنگ می دهد. این آزمایش برای شناسایی سودوموناس، نایسریا، آئروموناس، کمپیلوباکتر، ویبریو، بروسلا و پاستورلا استفاده می شود که همگی آن ها، این آنزیم سیتوکروم اکسیداز را تولید می کنند.
برای بررسی این تست، معرف ها و روش های بسیاری وجود دارد.
ارگانیسم های دارای سیتوکروم، یک آنزیم اکسیداز داخل سلولی تولید می کنند. این آنزیم اکسیداسیون سیتوکروم c را کاتالیز می کند. ارگانیسم هایی که nv بخشی از زنجیره تنفسی خود دارای سیتوکروم c هستند، اکسیداز مثبت بوده و معرف را آبی / بنفش می کنند و ارگانیسم های فاقد سیتوکروم c در زنجیره تنفسی، معرف را اکسید نمی کنند و در نتیجه ی آزمایش آن ها بی رنگ باقی می ماند که اکسیداز منفی تلقی می شوند.
باکتری های اکسیداز مثبت، سیتوکروم اکسیداز یا ایندوفنول اکسیداز (آهن حاوی هموپروتئین) دارند که هر دوی آن ها انتقال الکترون از ترکیبات دهنده الکترون (NADH) به گیرنده الکترون (معمولاً اکسیژن) را تسهیل می کنند.
سیستم سیتوکروم معمولاً فقط در موجودات هوازی وجود دارد که قادر به استفاده از اکسیژن به عنوان گیرنده نهایی هیدروژن هستند. محصول نهایی این متابولیسم، آب یا پراکسید هیدروژن (تجزیه شده توسط کاتالاز) است.
هدف و کاربردهای آزمایش اکسیداز
- تست اکسیداز برای بررسی وجود آنزیم سیتوکروم اکسیداز استفاده می شود.
- این آزمایش به عنوان تستی افتراقی جهت تمایز گونه های نیسریا، موراکسلا، کمپیلوباکتر و پاستورلا (اکسیداز مثبت) استفاده می شود.
- همچنین تست اکسیداز برای تمایز pseudomonads از گونه های مرتبط کاربرد دارد.
مراحل انجام تست اکسیداز
روش های متنوعی برای انجام این تست وجود دارد از جمله؛ کاغذ فیلتر، روش مستقیم، روش سواپ، روش نوار تست اکسیداز و روش لوله ای. در ادامه به روش کاغذ فیلتر اکسیداز می پردازیم.
روش کاغذ فیلتر خشک
- از آنجا که معرف اکسیداز ناپایدار است و باید برای آزمایش تازه باشد، این روش، یک روش خوب پیشنهادی است.
- کاغذ فیلتر شماره 1 Whatman در یک محلول 1٪ تازه ساخته شده از tertramethyl-p-phenylene-diamine dihydrochloride خیسانده می شود.
- پس از برداشتن آن ها بعد از حدود ۳۰ ثانیه، نوارها به صورت یخ زده خشک می شوند و در یک بطری تیره و محکم که در آن با درپوش پیچ شده بسته شده، نگهداری می شوند.
- برای انجام تست، یک نوار را برداشته و در ظرف پتری یا روی یک لام قرار می دهند. سپس سطح آن را با آب مقطر مرطوب می کنند.
- کلنی مورد آزمایش را با یک لوپ یا پی پت پاستور شیشه ای یا پلاستیکی برداشته و در منطقه مرطوب آغشته می کنند. (توجه شود در انجام این تست نباید از اشیای فلزی استفاده کرد چرا که نتیجه مثبت کاذب می دهند.)
- واکنش مثبت با یک رنگ بنفش تیره حدود ۵ تا ۱۰ ثانیه بعد قابل مشاهده است. یک واکنش “تأخیری مثبت” به صورت تغییر رنگ در ۱۰ الی ۶۰ ثانیه بعد نمایان می شود و نهایتا نتیجه ی منفی با بی رنگ ماندن کاغذ و یا تغییر رنگ در مدت زمانی بیش از ۶۰ ثانیه، نشان داده می شود.
محدودیت های تست اکسیداز
- معرف های استفاده شده در تست اکسیداز به صورت خودکار نیز اکسید می شوند، بنابراین استفاده از معرفهای تازه، بسیار مهم است.
- باكتري و مخمر رشد کرده در محيطی حاوی غلظت بالای گلوكز، فعاليت اكسيداز را مهار مي كنند، بنابراين توصيه مي شود از كلنی های رشد داده شده در محيطی بدون قند اضافي، مانند محیط آگار مغذی برای آزمایش استفاده شود
- باکتری های رشد یافته در محیط های حاوی رنگ ممکن است نتایج نادرستی به همراه داشته باشند.
- از تست اکسیداز می توان در شناسایی احتمالی نایسریا و یا در تمایز و شناسایی باسیل های گرم منفی استفاده کرد. ارگانیسم های اکسیداز مثبت باید ابتدا توسط رنگ آمیزی گرم مورد بررسی قرار گیرند تا مورفولوژی و واکنش گرم تعیین شود و سپس از آزمایش های بیوشیمیایی برای شناسایی کامل باکتری ها از نظر جنس و گونه کاربرد دارد.
- استفاده از لوپ حاوی نیکروم، آهن و یا ترکیبات مشابه آن ممکن است واکنش های مثبت کاذب ایجاد کند. لوپ های پلاتین، پلاستیکی و یا شیشه ای برای این تست توصیه می شود.
- بیشتر هموفیلوس ها اکسیداز مثبت هستند. نوارها یا معرف هایی که حساسیت کمتری دارند، ممکن است نتایج منفی کاذب داشته باشند.
- برای این تست، استفاده از کلنی هایی با عمر ۱۸-۲۴ ساعت توصیه می شود. کلنی های قدیمی واکنش های ضعیف تری ایجاد می کنند.