درباره EMB آگار
ائوزین متیلن بلو آگار (Eosin Methylene Blue (EMB) agar) یک محیط میکروبیولوژیکی متمایز است که رشد باکتری‌های گرم مثبت را اندکی مهار می‌کند و نشانگر رنگی است که بین ارگانیسم‌هایی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند (مانند E. coli) و ارگانیسم‌هایی که انجام نمی‌دهند (مانند سالمونلا) تمایز می‌دهد. ، شیگلا).
EMB آگار در ابتدا توسط Holt-Harris و Teague ابداع شد و توسط Levine اصلاح شد.
بنابراین ترکیبی از فرمول‌های Levine و Holt-Harris و Teague است که حاوی یک هضم پپتیک از بافت حیوانی و فسفات توصیه شده توسط Levine و دو کربوهیدرات مطابق پیشنهاد Holt-Harris و Teague است.
این محیط در آزمایشگاه‌های پزشکی برای تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا گرم منفی در مدت زمان کوتاه اهمیت دارد.
قاعده کلی EMB آگار
- EMB آگار با ترکیبی از دو رنگ ائوزین و متیلن بلو در نسبت 6:1 مشخص می‌شود.
- باکتری‌های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند اسید تولید می‌کنند که pH را کاهش می‌دهد. این امر جذب رنگ توسط کلنی‌ها را تشویق می‌کند و با اثر اسید روی رنگ‌ها، کلنی‌ها را بنفش تیره می‌کند.
- علاوه بر این، برخی از باکتری‌های تخمیر لاکتوز، کلنی‌های مسطح و تیره با درخشش فلزی سبز تولید می‌کنند.
- سایر تخمیرکننده‌های لاکتوز کلنی‌های بزرگتر و مخاطی تولید می‌کنند که اغلب فقط مرکز آنها بنفش رنگ است.
- در EMB آگار، بیشتر سویه کلنی‌های coli سبز رنگ مشخص هستند. تخمیر سریع لاکتوز و تولید اسیدهای قوی، بنابراین کاهش سریع EMB Agar ph. عامل حیاتی در تشکیل جلای فلزی سبز مشاهده شده با E.coli، تخمیر سریع لاکتوز و تشکیل اسیدهای قوی است.
- از سوی دیگر، لاکتوز غیر تخمیری ممکن است با دآمیناسیون (deamination) ph پروتئین‌ها را افزایش دهد. این تضمین می‌کند که رنگ جذب نمی‌شود و کلنی‌ها بی رنگ خواهند بود.
- بنابراین تخمیر نشده لاکتوز یا بی رنگ یا به رنگ اسطوخودوس روشن هستند.
- هضم پپتیک (Peptic ) بافت حیوانی به عنوان منبع کربن، نیتروژن و سایر مواد مغذی برای رشد ضروری است.
- لاکتوز و ساکارز منابع انرژی هستند زیرا کربوهیدرات‌های قابل تخمیر هستند.
- ائوزین-Y و متیلن بلو (methylene blue) به عنوان شاخص‌های افتراقی عمل می‌کنند. فسفات محیط را بافر می‌کند.
تهیه و روش استفاده از EMB آگار
- ۹۶ گرم را در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر معلق کنید.
- مخلوط کنید تا سوسپانسیون (suspension ) یکنواخت شود. حرارت دهید تا به جوش آید و کاملا حل شود.
- با اتوکلاو (autoclaving ) با فشار 15 پوند (121 درجه سانتیگراد) به مدت 15 دقیقه استریل کنید. از گرمای بیش از حد خودداری کنید.
- تا دمای 50-45 درجه سانتیگراد خنک کنید و محیط را تکان دهید تا متیلن بلو (methylene blue) اکسید شود (یعنی رنگ آبی آن بازگردد) و رسوب فلوکولنت (flocculent ) به حالت تعلیق درآید.
- داخل صفحات پتری (Petri ) استریل بریزید.
- اجازه دهید صفحات تا دمای اتاق گرم شوند.
- سطح Agar باید قبل از تلقیح خشک شود.
- نمونه را در اسرع وقت پس از جمع آوری تلقیح و رگه بزنید.
- اگر نمونه‌ای که قرار است کشت شود روی سواب (swab) است، سواب را روی ناحیه کوچکی از سطح Agar بغلتانید و برای جداسازی با یک حلقه استریل رگه بزنید.
- پلیت‌ها را به صورت هوازی در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۱۸-۲۴ ساعت انکوبه کنید و از نور محافظت کنید.
- صفحات را برای مورفولوژی (morphology) بررسی کنید. اگر بعد از 24 ساعت منفی بود، 24 ساعت دیگر دوباره انکوبه کنید.
موارد استفاده از EMB آگار
- EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar) برای جداسازی و تمایز باکتری‌های روده‌ای گرم منفی از نمونه‌های بالینی و غیر بالینی توصیه می‌شود.
- در افتراق باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی مفید است.
- به جداسازی و تمایز باسیل‌های روده و باسیل‌های گرم منفی کمک می‌کند.
- از آن برای آزمایش کیفیت آب استفاده می‌شود، به ویژه برای تعیین اینکه آیا آب توسط میکروارگانیسم‌های مضر آلوده شده است.
- این میکروارگانیسم‌ها را در گروه کولون-تیفوئید-اسهال خونی متمایز می‌کند.
- EMB به تمایز بصری اشریشیا کلی، سایر میله‌های گرم منفی روده‌ای تخمیر کننده لاکتوز غیر بیماری‌زا و جنس سالمونلا (Salmonella) و شیگلا (Shigella) کمک می‌کند.
- همچنین به جداسازی و تمایز باسیل‌های روده‌ای تخمیر کننده لاکتوز و باسیل‌های روده‌ای غیر لاکتوزی کمک می‌کند.
محدودیت‌های EMB آگار
- یک محیط تصادفی باید همراه با EMB آگار تلقیح شود.
- توصیه می‌شود برای شناسایی کامل آزمایشات بیوشیمیایی (biochemical)، ایمونولوژیکی (immunological)، مولکولی (molecular) یا طیف سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
- برخی از سویه‌های سالمونلا (Salmonella) و شیگلا (Shigella) ممکن است در EMB آگار رشد نکنند.
- برخی از باکتری‌های گرم مثبت مانند انتروکوک‌ها (enterococci)، استافیلوکوک‌ها (staphylococci) و مخمرها روی این محیط رشد می‌کنند و معمولاً کلونی‌های دقیقی را تشکیل می‌دهند.
- موجودات غیر بیماری‌زا و غیر تخمیری لاکتوز نیز در این محیط رشد خواهند کرد. برای تشخیص این موجودات از سویه‌های بیماری‌زا، باید آزمایش‌های بیوشیمیایی بیشتری انجام شود.
- ممکن است برای اطمینان از جداسازی کافی نمونه‌های فلور مخلوط مورد نیاز باشد.
- برخی از سویه‌های coli ممکن است نتوانند یک درخشش فلزی سبز مشخص ایجاد کنند. در نتیجه، جلای فلزی سبز برای E.coli تشخیصی نیست.