همه چیز در مورد محیط کشت سیمون سیترات

مقدمه

سیمون سیترات آگار یک محیط کشت آگار برای افتراق باکتر­ی‌های انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) بر اساس استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن می‌باشد.

در اوایل دهه 1920، Koser فرمولی برای یک محیط کشت مایع جهت افتراق باکتری‌های کلیفرم­ (Coliform) مدفوعی از گروه باکتر­ی‌های کلیفرم، بسط داد. سیمونز بعداً این فرمول را اصلاح کرد تا با تولید یک محیط کشت جامد، خطاهای احتمالی را هنگام تفسیر نتایج حذف کند.

ترکیبات سیمون سیترات آگار

مواد لازم در هر لیتر آب دیونیزه:

آب دیونیزه: ۱۰۰۰ میلی لیتر
pH نهایی: 0.2±6.9 در 25 درجه سانتی‌گراد.

اصول سیمون سیترات آگار

سیمون سیترات آگار برای آزمایش توانایی ارگانیسم در استفاده از سیترات به عنوان منبع انرژی به کار برده می‌شود. آمونیوم دی‌هیدروژن فسفات (Ammonium Dihydrogen Phosphate) تنها منبع نیتروژن است. دی‌پتاسیم فسفات (Dipotassium Phosphate) به عنوان یک بافر عمل می‌کند. کلرید سدیم تعادل اسمزی محیط را حفظ می‌کند. سیترات سدیم تنها منبع کربن در این محیط است.

سولفات منیزیم یک کوفاکتور برای انواع واکنش‌های متابولیکی است. محیط کشت باکتریولوژیک آگار (Bacteriological agar) عامل انجماد است. ارگانیسم‌هایی که قادر به استفاده از آمونیوم دی‌هیدروژن فسفات و سیترات هستند بدون محدودیت در این محیط رشد می‌کنند. اگر بتوان از سیترات استفاده کرد، میکروب فرآورده‌های جانبی قلیایی یا پایه را انباشته خواهد کرد.

باکتری‌هایی که می‌توانند روی این محیط رشد کنند، آنزیمی به نام سیترات پرمئاز (Citrate-permease) تولید می‌کنند که قادر به تبدیل سیترات به پیرووات (Pyruvate) است. سپس پیرووات می­تواند برای تولید انرژی وارد چرخه متابولیک ارگانیسم شود. رشد نشان دهنده استفاده از سیترات که یک متابولیت واسطه‌ای در چرخه کربس (Krebs cycle) است، می‌باشد.

هنگامی که باکتری‌ها سیترات را متابولیزه می‌کنند، نمک‌های آمونیوم به آمونیاک تجزیه می‌شوند که قلیائیت را افزایش می‌دهد. تغییر pH موجب تغییر رنگ نشانگر بروموتیمول بلو (bromothymol blue) در محیط از سبز به آبی در PH بالاتر از ۷.۶ می‌شود.

موارد استفاده از سیمون سیترات آگار

1. برای افتراق باکتری‌های گرم منفی بر اساس استفاده از سیترات به کار می‌رود.
2. سیمون سیترات آگار ممکن است برای افتراق باکتری‌های سیترات مثبت سالمونلا انتریتیدیس (Salmonella enteritidis) و اعضای زیرجنس سالمونلا II، III و IV از گونه‌های سیترات منفی سالمونلا تیفی (Salmonella typhi)، سالمونلا پاراتیفی A (Salmonella paratyphi A)، سالمونلا پولوروم (Salmonella pullorum) و سالمونلا گالیناروم (Salmonella gallinarum)، استفاده شود.
3. سیمون سیترات آگار در درجه اول برای کمک به شناسایی انتروباکتریاسه استفاده می‌شود. موارد استفاده آن عبارتند از:

• افتراق اشریشیا کلی (Escherichia coli) (معمولا -) و گونه‌های شیگلا (Shigella) (-) از سایر موارد رایج
• شناسایی انتروباکتریاسه (متغیر +).
• افتراق گونه‌های ادواردسیلا (Edwardsiella) (-) از گونه‌های سالمونلا (معمولا +)
• افتراق Serratia proteamaculans (+) از یرسینیا سودوتوبرکلوزیس (Yersinia pseudotuberculosis) (-) و یرسینیا انتروکولیتیکا (Yersinia enterocolitica) (معمولا -)
• افتراق گروه‌های کلبسیلا-انتروباکتر (Klebsiella-Enterobacter) (معمولا +) از اشریشیا کلی (معمولا -)
• افتراق پروتئوس رتگری (Proteus rettgeri) (+) از بیوگروپ‌های مورگانلا مورگانى (Morganella morganii biogroups) 1 و 2 (-)
• افتراق Yokenella regensburgei (+) از هافنیا آلوئی (Hafnia alvei) (-)
• افتراق Leminorella grimontii (+) از richardii (-)
• افتراق Acidovorax delafieldii (+) از facilis (-) و A. temperans (-)

روش آماده‌سازی سیمون سیترات آگار

1. نمک‌های بالا را در آب دیونیزه حل کنید.
2. pH را روی 6.9 تنظیم کنید.
3. آگار و بروموتیمول بلو را اضافه کنید.
4. به آرامی همراه با هم زدن حرارت دهید تا بجوشد و آگار حل شود.
5. این محیط ممکن است در لوله‌های آزمایش یا در پتری دیش‌ها (Petri dish) استفاده شود. در هر دو مورد، سطح محیط به آرامی با کشت خطی شیب‌دار تلقیح می‌شود و عمق محیط با ضربه زدن تلقیح می‌شود.
6. برای لوله‌ها، ۴ تا ۵ میلی‌لیتر از محیط کشت را در لوله‌های ۱۶ میلی‌متری بریزید.
7. لوله را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد تحت فشار 15 psi به مدت 15 دقیقه، اتوکلاو کنید.
8. در حالت مایل (سطح زیاد و عمق کم) محیط را خنک کنید.
9. لوله‌ها باید در یخچال نگه‌داری شوند تا از ۶ تا ۸ هفته ماندگاری محیط اطمینان حاصل شود.
10. محیط تلقیح نشده به دلیل pH نمونه و برموتیمول بلو، سبز جنگلی تیره خواهد بود.

تفسیر نتایج در سیمون سیترات آگار

رشد مثبت (یعنی استفاده از سیترات) یک واکنش قلیایی ایجاد می‌کند و رنگ محیط را از سبز به آبی روشن تغییر می‌دهد.

مثال­: باکتری‌های سراشیا (Serratia) و اکثر گونه‌های انتروباکتر (Enterobacter)، سیتروباکتر (Citrobacter)، کلبسیلا، پروتئوس و پروویدنسیا (Providencia)، به جز مورگانلا مورگانی و کلبسیلا راینوسکلروماتیس (Klebsiella rhinoscleromatis).

تست منفی (یعنی عدم استفاده از سیترات): رنگ محیط بدون تغییر باقی می‌ماند.

مثال: باکتری‌های اشریشیا کلی، شیگلا، یرسینیا، گونه‌های ادواردسیلا و غیره.

محدودیت‌های سیمون سیترات آگار

1. هیچ ماده مغذی را نباید به محیط سیترات منتقل کنید، زیرا این امر باعث می‌شود که نتیجه آزمایش به طور کاذب مثبت شود.
2. برخی از ارگانیسم‌ها قادر به رشد در سیترات هستند، ولی تغییر رنگ ایجاد نمی‌کنند. در اینجا تست استفاده از سیترات حتی در صورت عدم تغییر رنگ، مثبت در نظر گرفته می‌شود.
3. تست‌هایی که نتایج مبهم دارند باید تکرار شوند.
4. واکنش‌ها در این محیط کشت به تنهایی برای شناسایی در سطح گونه‌ای کافی نیست.
5. تلقیح باید از یک کشت خالص و یک شبه رشد کرده روی یک محیط جامد باشد و نه از سوسپانسیون براث (Broth).

کنترل کیفیت در سیمون سیترات آگار

کنترل مثبت: با استفاده از سویه استاندارد Klebsiella pneumoniae ATCC® 13883  که منجر به تغییر رنگ محیط کشت به آبی می‌شود.

کنترل منفی: با استفاده از سویه استاندارد Escherichia coli ATCC® 25922، رشد مهار شده یا بدون رشد را موجب می‌شود و رنگ محیط بدون تغییر باقی می‌ماند.