روش انجام آزمایش PYR- آزمایش PYR

مقدمه‌ای بر تست PYR

تست PYR (پیرولیدونیل آمینوپپتیداز (Pyrrolidonyl Aminopeptidase)) برای تشخیص فعالیت پیرولیدونیل آریل‌آمیداز (Pyrolidonyl arylamidase) که پیرولیدونیل آمینوپپتیداز (Pyrrolidonyl aminopeptidase) نیز نامیده می‌شود، در استرپتوکوک پیوژنز (Streptococcus pyogenes)، گونه‌های انتروکوکوس (Enterococcus)، برخی از استافیلوکوکوس‌های کواگولاز منفی (Coagulase-negative staphylococci) و برخی از انتروباکتریاسه‌ها (Enterobacteriaceae) استفاده می‌شود.

این تست همچنین به عنوان PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide) شناخته می‌شود که به عنوان بستری برای شناسایی پیرولیدونیل پپتیداز (pyrrolidonyl peptidase) عمل می‌کند.

Facklam، Thacker، Fox و Eriquez گزارش کردند که 98٪ استرپتوکوک‌های گروه A و 96٪ انتروکوک‌های گروه D، PYR را هیدرولیز می‌کنند. اگرچه گونه‌های آئروکوکوس (Aerococcus) به ندرت در آزمایشگاه بالینی ایزوله می‌شوند، انتظار می‌رود این ارگانیسم‌ها نیز PYR را هیدرولیز کنند.

Facklam و همکاران در ادامه گزارش دادند که 98 درصد استرپتوکوک‌های گروه B، 100 درصد استرپتوکوک‌های غیر گروه A، B و D، 100 درصد غیر انتروکوک‌های گروه D و 82 درصد استرپتوکوک‌های ویریدانس (Viridans) نتایج تست PYR منفی دارند.

اصول تست PYR

PYR یک روش سریع برای شناسایی احتمالی باکتری‌ها بر اساس آنزیم پیرولیدونیل آریل‌آمیداز است. آنزیم L-پیرولیدونیل آریل‌آمیداز، سوبسترای L- پیرولیدونیل- β- نفتیل‌آمید را هیدرولیز می‌کند تا یک β-نفتیل‌آمین (β-naphthylamine) تولید کند. β-نفتیل‌آمین را می‌توان در حضور شناساگر N,N-متیل‌آمینو‌سینامالدئید (N,N-methylaminocinnamaldehyde) با تولید یک رسوب قرمز روشن تشخیص داد.

پس از هیدرولیز سوبسترا توسط پپتیداز (Peptidase)، β-نفتیل‌آمید حاصل با افزودن  شناساگر سینامالدئید 0.01٪، رنگ قرمز تولید می‌کند. هنگامی که یک تلقیح قابل مشاهده از میکروارگانیسم روی ناحیه کوچکی از دیسک آغشته به سوبسترا مالیده می‌شود، هیدرولیز در عرض 2 دقیقه اتفاق می‌افتد، در این زمان شناساگر سینامالدئید اضافه می‌شود تا واکنش را با تغییر رنگ به ارغوانی تشخیص دهد.

موارد استفاده از تست PYR

1. برای شناسایی احتمالی استرپتوکوک‌های گروه A (استرپتوکوک پیوژنز) استفاده می‌شود.
2. برای افتراق سریع انتروکوک‌ها از استرپتوکوک‌های بتا همولیتیک (β-hemolytic) گروه D استفاده می‌شود.
3. همچنین جهت افتراق برخی از استافیلوکوک‌ها (استافیلوکوک‌های همولیتیکوس مثبت از auricularis منفی) استفاده می‌شود.
4. در شناسایی coli استفاده می‌شود و آن را از سایر باکتری‌های میله‌ای ایندول مثبت، لاکتوز مثبت و گرم منفی تفکیک می‌کند.

روش تست PYR

روش براث

1. براث PYR را با 3 تا 5 کلنی از کشت خالص 18 تا 24 ساعته تلقیح کنید.
2. لوله را به صورت هوازی در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴ ساعت انکوبه کنید.
3. 2 تا 3 قطره شناساگر PYR اضافه و تغییر رنگ را بررسی کنید.
4. ایجاد رنگ قرمز را در عرض ۱ الی ۲ دقیقه بررسی کنید.

روش دیسک (سریع)

5. دیسک آزمایش PYR را روی استریپ با 10 میکرولیتر آب مقطر استریل یا آب دیونیزه خیس کنید.

توجه: دیسک را غرق در آب مقطر نکنید.

6. 5 تا 10 کلنی از سویه مورد آزمایش را از کشت 18 تا 24 ساعته با استفاده از لوپ (Loop) روی سطح دیسک قرار داده و به آرامی روی آن بمالید.
7. دیسک را به مدت ۱ تا ۲ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
8. پس از انکوباسیون، 1 قطره شناساگر N,N-دی‌متیل‌آمینو‌سینامالدئید اضافه کنید.
9. ایجاد رنگ قرمز را در عرض ۱ الی ۲ دقیقه بررسی کنید.

تفسیر نتایج تست PYR

مثبت: ایجاد رنگ صورتی روشن یا قرمز گیلاسی در عرض ۱الی ۲ دقیقه.

مثال:

• استرپتوکوک‌های گروه A (استرپتوکوک پیوژنز)
• انتروکوک‌های گروه D (انتروکوکوس فکالیس (Enterococcus faecalis) و انتروکوکوس فاسیوم (Enterococcus faecium))
• گونه‌های استافیلوکوک کوآگولاز منفی مانند استافیلوکوکوس همولیتیکوس (S. hemolyticus)
• استافیلوکوک لوگدوننسیس (S. lugdunensis)
• استافیلوکوک شلیفری (S. schleiferi). انتروباکتر (Enterobacter)
• سیتروباکتر (Citrobacter)
• کلبسیلا (Klebsiella)
• یرسینیا (Yersinia) و سرراتیا (Serratia)
• آئروکوکوس (Aerococcus)
• گاملا (Gamella)
• لاکتوکوکس (Lactococcus)
• اکثر کورینه باکتریوم (آرکانوباکتریوم) همولیتیکوم‌ها (Corynebacterium (Arcanobacterium) hemolyticum)

منفی: بدون تغییر رنگ یا ایجاد رنگ آبی به دلیل واکنش مثبت ایندول.

مثال:

• استرپتوکوک‌های گروه B (Streptococcus agalactiae)
• استرپتوکوک میتیس (Streptococcus mitis)
• استرپتوکوک بوویس (S. bovis)
• استرپتوکوک اکینوس (S. equinus)
• استرپتوکوک میلری (S. milleri)

توجه: یک واکنش با رنگ صورتی کم رنگ (ضعیف) منفی در نظر گرفته می‌شود.

کنترل کیفیت تست PYR

کنترل مثبت: انتروکوکوس فکالیس (ATCC29212)، استرپتوکوک پیوژنز (ATCC19615)

کنترل منفی: استرپتوکوک آگالاکتیه (ATCC10386)

محدودیت‌های تست PYR

1. PYR ممکن است در جداسازی احتمالی استرپتوکوک‌های گروه A و انتروکوک‌های گروه D از سایر استرپتوکوک‌ها استفاده شود. از این رو برای شناسایی کامل، آزمایشات تکمیلی با استفاده از کشت خالص توصیه می‌شود.
2. اگر دیسک یا کاغذ فیلتر بیش از حد مرطوب باشد، ممکن است موجب ایجاد تست منفی کاذب شود.
3. اگر از محیط‌های انتخابی یا از آگارهای بیوشیمیایی در لوله‌ آزمایش برای تلقیح استفاده شود، می‌تواند منجر به ایجاد تست‌های منفی کاذب شود.
4. اشریشیا کلی و پروتئوس (Proteus) ایندول مثبت به دست آمده از محیط‌های حاوی مقادیر زیاد تریپتوفان (Tryptophan)، ممکن است باعث ایجاد رنگ سبز آبی شود. در این مورد نتیجه تست منفی است.
5. برخی از ایزوله‌های لاکتوکوکی (Lactococci) و آئروکوکی (Aerococci) که کمتر دیده می‌شوند، ممکن است PYR مثبت باشند.
6. اگر نتایج پس از ۲۰ ثانیه خوانده شود، ممکن است واکنش‌های رنگی غیرمشخص رخ دهد.