روش انجام آزمایش KOH- آزمایش KOH

مقدمه‌ای بر تست KOH

تست KOH که به نام KOH mount یا KOH preparation نیز شناخته می‌شود، یک تست سریع است که برای نمایان کردن ساختارهای قارچی در نمونه‌های بالینی با استفاده از هیدروکسید پتاسیم (KOH) به عنوان یک شناساگر پاک‌کننده، استفاده می‌شود.

مشاهده میکروسکوپی ساختار قارچ، روش مهمی برای شناسایی گونه‌های قارچی است. مشاهدات میکروسکوپی نمونه‌های بالینی در آزمایشگاه‌های بالینی انجام می‌شود تا حضور قارچ‌ها همراه با ساختار آن‌ها قبل از کشت یا قرار دادن نمونه در معرض هر روش آزمایشی شناسایی قارچ‌ها، مشخص شود.

از روش‌های India ink preparation، رنگ‌آمیزی گیمسا (Giemsa)، رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف (Periodic-acid-Schiff)، رنگ‌آمیزی  گروکوت متنامین سیلور (Grocott’s methenamine silver stain)، کالکوفلور مانت (Calcofluor mount) و KOH mount به طور معمول در آزمایشگاه‌های تشخیصی برای بررسی میکروسکوپی نمونه‌های بالینی استفاده می‌شوند.

در تست KOH، مایکوزها (Mycose) با مشاهده وجود پاتوژن‌های قارچی در نمونه بالینی به سرعت تشخیص داده می‌شوند. این امر میکروبیولوژیست را در مورد مورفولوژی قارچ راهنمایی کرده و به شناسایی احتمالی دسته‌های قارچ کمک می‌کند.

همچنین کمک می‌کند تا تعیین کنیم نیاز به کشت وجود دارد یا خیر و در صورت نیاز از چه نوع محیط‌های کشت استفاده کنیم. این تست به عنوان آسان‌ترین، ساده‌ترین و ارزان‌ترین روش مشاهده قارچ، به طور گسترده در آزمایشگاه‌های تشخیصی استفاده می‌شود.

اهداف تست KOH

• برای تصویرسازی قارچ‌ها و ساختار آن‌ها در یک نمونه بالینی.
• برای شناسایی احتمالی درماتوفیت‌ها (Dermatophyte).
• برای تشخیص اولیه مایکوز.

اصول تست KOH

هیدروکسید پتاسیم مواد پروتئینی موجود در نمونه‌های بالینی از جمله کراتین، مواد چسبنده‌ای که سلول‌های کراتینه شده را در کنار هم نگه می‌دارند و سایر موادی که بافت حساس به قلیا دارند را حل می‌کند.

این امر منجر به تجزیه اجزای سلولی می‌شود. از این رو نمونه را شفاف، اتصال قارچ‌ها به مواد پروتئینی را باز و عناصر قارچی را به وضوح قابل مشاهده می‌کند. با این حال، اجزای قارچی در برابر قلیا مقاوم هستند، بنابراین دست نخورده باقی می‌مانند. در نتیجه امکان تصویرسازی واضح مورفولوژی میکروسکوپی قارچ‌ها و عناصر قارچی در نمونه فراهم می‌شود.

نیازمندی‌های تست KOH

1. شناساگرها

محلول 10 تا 30 درصد KOH به عنوان یک شناساگر در تست KOH mount استفاده می‌شود.

ترکیب و روش آماده‌سازی محلول‌های KOH (100 میلی‌لیتر)

وزن پلت‌های KOH (بر حسب گرم)	حجم آب مقطر (بر حسب میلی‌لیتر)	غلظت نهایی محلول KOH (درصد وزنی – حجمی)
۱۰	۹۰	۱۰%
۲۰	۸۰	۲۰%
۳۰	۷۰	۳۰%

روش آماده‌سازی

• در یک بشر آزمایشگاهی استریل، مقدار مناسب پلت KOH را اضافه کرده و به مقدار لازم آب مقطر استریل بریزید تا محلول KOH به غلظت مورد نیاز برسد. (برای تعین میزان KOH و آب به جدول بالا مراجعه کنید.)
• مخلوط را به طور مناسب تکان دهید تا پلت KOH کاملاً حل شود. (در صورت وجود از همزن مغناطیسی یا شیکر (Shaker) استفاده کنید.)

2. تجهیزات

PPE و سایر تجهیزات آزمایشگاهی عمومی

3. نمونه/ نمونه‌ها

همه انواع نمونه‌های بالینی را می‌توان برای تست KOH استفاده کرد. به طور کلی، نمونه‌ها شامل خراش پوستی، ناخن کوتاه شده، مو، چرک، خلط، مایع مغزی نخاعی (CSF)، نمونه بافت (بیوپسی)، ادرار، سواب غشایی مخاطی، شستشوی برونش (Bronchial) و آلوئولار (alveolar) و غیره است.

نمونه‌ها غلظت KOH را تعیین می‌کنند. برای خلط، چرک، مایع مغزی نخاعی، ادرار و سواب‌ها، محلول KOH 10 درصد برای حل کردن بقایای بافتی موثر است. برای خراش پوست، برخی سواب‌ها با تعداد زیادی بقایای بافت، نمونه‌های بافتی و چرک غلیظ، KOH با 20 درصد غلظت کار را بهتر و سریع‌تر انجام می‌دهد. و برای نمونه‌های محکم مانند ناخن و مو باید از 30% KOH استفاده کرد تا ضایعات و کراتین‌ها سریع و کامل حل شوند.

روش تست KOH

روش KOH Mount

1. در یک لام شیشه‌ای تمیز و استریل، یک قطره از KOH را بریزید. (غلظت KOH به نمونه بستگی دارد.)
2. بخش کوچکی از نمونه را روی قطره KOH منتقل کنید و آن را روی لامل قرار دهید.
3. مخلوط نمونه و KOH را در دمای اتاق به مدت 5 تا 30 دقیقه (زمان بسته به نمونه متفاوت است) برای پاکسازی نمونه و هضم ضایعات سلولی انکوبه کنید.

* خلط، چرک، CSF، ادرار و اسمیر نازک چرک را به مدت 5 تا 10 دقیقه انکوبه کنید.

* خراش‌های پوست، سواب‌های ضخیم، چرک غلیظ و نمونه‌های بافت را حدود ۲۰ دقیقه انکوبه کنید.

* تکه‌های مو و ناخن را به مدت ۳۰ دقیقه انکوبه کنید.

توجه: حرارت دادن محلول روی شعله یا در هات بلاک یا انکوباسیون در دمای 300 درجه سانتی‌گراد فرآیند هضم را تسریع می‌کند. اما اجازه ندهید که KOH بجوشد یا خشک شود. برای جلوگیری از چنین مواردی، لام شیشه‌ای را روی کاغذ صافی مرطوب شده در یک پلیت پتری قرار دهید.

5. زیر میکروسکوپ نوری مرکب بررسی کنید. ابتدا در توان کم (بزرگ نمایی 100 X)، سپس با توان بالا (بزرگ نمایی 400 X). (نیازی به بزرگنمایی 1000 بار نیست.)

6. مورفولوژی قارچ، آرایش سلول‌ها/ هایف‌ها (Hyphae)، مورفولوژی و آرایش اسپور (Spore) قارچ را مشاهده و در مورد نمونه مو، محل قارچ‌ها در موها را بررسی کنید.

روش‌های KOH Mount اصلاح شده

KOH Mount برای کنتراست و رنگ آمیزی بهتر اصلاح شده است. امروزه تست‌های اصلاح شده KOH Mount برای تصویرسازی بهتر ترجیح داده می‌شوند:

KOH-Calcofluor Mount:

در این تست اصلاح شده، تمام مراحل و الزامات یکسان است، اما شناساگر برای رنگ‌آمیزی نمونه از KOH 10 تا 30 درصد به KOH 10 تا 30 درصد با 0.01 درصد کالکوفلور سفید (رنگ آبی فلورسنت که به سلولز (Cellulose) و کیتین (Chitin) اجزای قارچ مربوط است) تغییر می‌کند.

آماده‌سازی 20% KOH با 0.01% کلکوفلور سفید (100 میلی‌لیتر)

• 20 گرم پلت KOH را به 80 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کرده و خوب تکان دهید تا کاملا حل شود.
• به محلول ۰.۱ گرم پودر کلکوفلور سفید اضافه کرده و هم بزنید تا کریستال‌های کلکوفلور کاملا حل شوند.

Mount KOH-DMSO

در این تست اصلاح شده، تمام مراحل و الزامات یکسان است، اما شناساگر از KOH 10 تا 30 درصد به KOH 20 درصد و DMSO 40 درصد (دی‌متیل سولفوکسید (Dimethyl sulfoxide)) در آب مقطر برای پاکسازی بهتر نمونه هنگام مشاهده، تغییر می‌کند.

آماده‌سازی شناساگر KOH-DMSO (100 میلی‌لیتر)

• 60 گرم DMSO را به 90 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید تا محلول DMSO 40 درصد به دست آید.
• در 80 میلی‌لیتر محلول DMSO 40 درصد، 20 گرم پلت KOH اضافه کرده و با هم زدن کاملاً حل کنید.

نتیجه و تفسیر تست KOH

به وجود موارد ذیل در نمونه توجه کنید:

1. سلول‌های مخمر
2. شبه هایف‎ها (Pseudohyphae)
3. میسلیوم (Mycelium) قارچیانشعاب میسلیوم
4. جوانه‌زدن مخمرها
5. سپتوم (Septum) در میسلیوم
6. مورفولوژی (برآمدگی) در سلول‌های مخمر
7. ساختار و آرایش اسپورها
8. وجود ضایعات در مو و اسپور قارچ در داخل یا خارج ساقه مو

گزارش‌های پیشنهادی:

1. قارچی دیده نشد.
2. وجود سلول‌های مخمری.
3. سلول‌های مخمری با شبه هایف دیده می‌شود.
4. سلول‌های مخمری کپسوله دیده می‌شود.
5. میسلیوم دیده می‌شود.
6. میسلیوم‌های بدون دیواره (Aseptate) روبان مانند دیده می‌شود.
7. میسلیوم قارچی دیواره‌دار (Septate) دیده می‌شود
8. هایف‌های دیواره‌دار با ساختارهای تولیدمثلی / دوبخشی تقریبا 450 شاخه (مشخصه گونه‌های Aspergillus)
9. مثبت برای پیتریازیس ورسیکالر (Pityriasis versicolor) (در صورت مشاهده ترکیبی از مخمر گرد و هایف‌های کوتاه که به اصطلاح ظاهر اسپاگتی مانند و کوفته‌ای را شکل می‌دهند).
10. وجود Endothrix یا Ectothrix در ساقه مو.

موارد احتیاط در تست KOH

• قبل از مشاهده اجازه دهید ضایعات سلولی به طور کامل هضم شوند.
• در حین گرم کردن KOH، اجازه ندهید بجوشد یا خشک شود.
• از غلظت مناسب محلول KOH استفاده کنید.
• میکروسکوپ را برای تصویرسازی مناسب بررسی کنید.
• از اسلایدهای شیشه‌ای که خراش دارند، استفاده نکنید.

کاربردهای تست KOH

• تصویرسازی مورفولوژی قارچ
• تایید گونه‌های قارچی در نمونه بالینی
• تشخیص اولیه مایکوزها جهت انتخاب و شروع درمان ضد میکروبی مناسب
• شناسایی پیتریازیس ورسیکالر
• افتراق مخمرها و قارچ‌های رشته‌ای

مزایای تست KOH

• آسان برای انجام و ارائه سریع نتیجه
• به مواد / شناساگرها و مهارت‌های پیچیده و گران قیمت نیاز ندارند
• ایمن برای اجرا
• مناسب برای تمامی نمونه‌های بالینی

معایب و محدودیت‌های تست KOH

• این تست فقط یک تکنیک شناسایی فرضی است. بنابراین ما نمی‌توانیم گونه‌های قارچی را دقیقاً شناسایی کنیم.
• KOH رنگ و کنتراست برای اجزای قارچی ایجاد نمی‌کند.
• به یک فرد ماهر نیاز دارید تا دسته‌های قارچی را شناسایی کنید.
• برخی از مواد بافتی پیچیده ممکن است نیاز به زمان طولانی برای حل شدن داشته باشند یا ممکن است حل نشوند و در طول پروسه تصویرسازی قارچ‌ها مشکل ایجاد کنند.