شمارش دستی سلول های خونی
شمارش گلبول های سفید به روش دستی، جایگزین مناسبی برای دستگاه های سلکانترمی باشد ولی برای شمارش گلبول های قرمز و پلاکت ها کاربرد چندانی نداشته و ممکن است با خطای بالا همراه باشد. زیرا که در شرایط معمول در آزمایش CBC به روش دستی، حدود ۴۰۰ گلبول قرمز شمارش شده که موجب عدم دقت بالا در شمارش این سلول ها خواهد شد.
هموسیتومتر چیست؟
روش پیشنهادی برای شمارش دستی سلول های خونی، استفاده از لام (هموسیتومتر -Hemocytometer) (نئوبار اصلاح شده -Improved Neubauer counting chamber) می باشد. علت این امر این است که سلول ها بصورت واقعی مشاهده شده و تفکیک آنها از ذرات گرد و غبار و غیرسلولی، امکان پذیر بوده و این ذرات دیگر به عنوان سلول شمارش نمی شوند.
لام نئوبار معروف ترین، دقیق ترین و متداول ترین لام هماسیتومترمی باشد. این لام، حالت دو طرفه داشته و در هر سمت آن یک محفظه شمارش سلولی به شکل مکعب مربع و به ابعاد mm 0.1 × ۳× ۳ وجود دارد. این محفظه خود به یک مربع ۳ × ۳ با مجموع ۹ مربع به ابعاد mm 3× ۳ و عمق mm 0.1 تقسیم می شود که بعد از گذاشتن لامل سنگی، حجم یک مربع آن به ۰.۱ میلیمتر مکعب می رسد.
به چهار مربع گوشه، مربع های WBC و به مربع وسط، مربع RBC گفته می شود. جهت سهولت در شمارش دستی سلول های خونی، هر کدام از ۹ مربع به ۱۶ مربع مساوی تقسیم می شوند که حجم هر کدام معادل ۰.۰۰۶۲۵ میلیمتر مکعب می باشد. (۰.۲۵× ۰.۲۵ × ۰.۱)
در لام نئوبار اصلاح شده، ناحیه مرکزی یا همان مربع ،RBC به ۲۵ مربع مساوی تقسیم شده است. یعنی هر ضلع مربع میانی که ۱ mm می باشد، به ۵ قسمت تقسیم شده و بنابراین طول هرکدام ۰.۲ mm و حجم هر یک از آن ها، ۰.۰۰۴ = ۰.۱ × ۰.۲ × ۰.۲ mm3 خواهد بود.
هر کدام از این ۲۵ مربع نیز به ۱۶ مربع دیگر تقسیم می شوند. در نهایت مربع میانی دارای ۴۰۰ مربع کوچک خواهد بود که طول هر کدام، ۰.۰۵ mm و حجم هر یک از آن ها، ۰.۰۰۰۲۵ mm3 خواهد بود.
- هموسیتومتر از مربع های بزرگ گوشه ای (Aو Bو Cو D) جهت شمارش گلبول های سفید استفاده می شود.
- از پنج مربع آبی در مرکز، جهت شمارش گلبول های قرمز یا پلاکت ها، و از ۱۰مربع سبز+آبی جهت شمارش پلاکت ها استفاده می شود.
- در واقع هر یک از ۲۵مربع در یک میلیمتر مربع مرکزی، در درون خود ۱۶مربع کوچکتر جهت تسهیل شمارش دارند.
- شکل پایین، نمای کناری محفظه شمارش همراه با پوشش شیشه ای روی هموسیتومتر را نشان می دهد.
شمارش سلول ها بصورت غلظت یا تعداد سلول ها در واحد حجم بیان می شود. از آنجا که محفظه هموسیتومتر ابعاد خطی دارد، واحد حجم بصورت میلیمتر مکعب گزارش می شود. اگرچه هماهنگی در متون پزشکی در مورد استفاده از واحدهای مرسوم در برابر استفاده از سیستم بین المللی واحدها (SI) وجود ندارد، ولی ICSH توصیه می کند واحد حجم بصورت لیتر گزارش شود:
| RBCs: WBCs: PLTs: | ۵×۱۰۶/mm3 = 5×۱۰۶/μL = ۵×۱۰۱۲/L ۷×۱۰۳/mm3 = 7×۱۰۳/μL = ۷×۱۰۹/L ۳۰۰×۱۰۳/mm3 = 300×۱۰۳/μL = ۳۰۰×۱۰۹/L |
جدول یک: واحدهای اندازه گیری SI در هموسیتومتر
هموسیتومتر و لامل سنگی پس از هر بار استفاده باید بلافاصله با آب گرم شسته شده و با پارچه تمیز بدون پرز، پاک و در هوا خشک شود. سطح این لام نباید با گاز یا پارچه زبر تماس داده شود، زیرا باعث خراشیدگی خطوط روی لام می شود.
لازم به ذکر است که شمارش دستی سلول های خونی با هموسیتومتر دارای خطامی باشد که میتوان با تکرار حداقل ۳ باره آزمایش CBC به روش دستی، میزان خطا را تا حدود بالایی کاهش داد.
شمارش گلبول های قرمز
برای شمارش گلبول های قرمز، از محلول هایی استفاده می شود که هم خاصیت ایزوتونیک و هم خاصیت رقیق کنندگی داشته باشند. این محلول ها منجر به لیز سلول های خونی نمی شوند. محلول های مورد استفاده برای شمارش دستی سلول های خونی (ویژه گلبول های قرمز) عبارتند از:
| محلول Hyme | محلول Gower | محلول Toison | |||
| ۵ گرم | سولفات سدیم | ۱۲.۵ گرم | سولفات سدیم | ۸ گرم | سولفات سدیم |
| ۰.۵ گرم | کلرورجیوه(مرکوریک) | ۳۳.۳ میلی لیتر | اسیداستیک گلاسیال | ۰.۵ گرم | کلرورجیوه(مرکوریک) |
| ۱ گرم | کلرور سدیم | ۲۰۰ میلی لیتر | آب مقطر | ۳۰ میلی لیتر | گلیسرول |
| ۲۰۰ میلی لیتر | آب مقطر | ۱۶۰ میلی لیتر | آب مقطر | ||
جدول دو: مححلول های شمارش دستی سلول های خونی (گلبول های قرمز)
در برخی موارد مانند هایپرگاماگلوبولینمی، استفاده از محلول هایم باعث رسوب پروتئین، ایجاد رولو و آگلوتیناسیون RBC می شود. در این گونه موارد، استفاده از محلول گاور توصیه می شود زیرا که اسیداستیک موجود در آن، از ایجاد رولو و همچنین آگلوتیناسیون گلبول های قرمز، جلوگیری می کند.
بجز محلول های فوق، محلول ابداعی لوئیس-دیسی (LD) نیز وجود دارد که از ۱ mL فرمالین، ۹۹ mL سیترات سدیم %۳ و ۹۰۰ mL آب مقطر تشکیل شده است. این محلول بایستی دور از نور آفتاب و در شیشه های قهوه ای رنگ نگهداری شود. به علت وجود فرمالین، نیازی به استریل کردن ندارد. طول عمر مفید این محلول، سه هفته بوده و استفاده بیش از این مدت با نتایج مطلوبی همراه نخواهد بود.
RBCها در محلول LD حالت مقعرالطرفین خود را حفظ کرده و خودبخود آگلوتینه نمی شوند. همچنین این محلول باعث می شود تا سلول ها به هم متصل نشده و تا چند ساعت پس از رقیق کردن خون با آن، سوسپانسیون سلولی پایدار بوده و RBC های آن سالم باقی می مانند.
در صورتی که بیمار مبتلا به اتوآگلوتیناسیون و یا آگلوتیناسیون سرد باشد، بهتر است محلول رقیق کننده بدون فرمالین استفاده کنیم، زیرا که خود فرمالین باعث تثبیت ذرات آگلوتینه شده و حتی با مخلوط کردن سوسپانسیون از هم جدا نمی شوند.
نحوه شمارش
در صورت استفاده از ملانژور قرمز جهت شمارش گلبول های قرمز، خون EDTA دار را تا درجه ۰/۵ ملانژور کشیده، اطراف وک ملانژور را با پنبه یا گاز تمیز پاک کرده، درون محلول رقیق کننده قرار داده و تا درجه ۱۰۱ آن را پر می کنیم. رقت بدست آمده ۲۰۰/۱ خواهد بود.
لامل سنگی را بر روی لام نئوبار قرار داده و قطره کوچکی از سوسپانسیون تهیه شده را بین لام و لامل قرار می دهیم.
سوسپانسیون طبق خاصیت موئینه در بین لام و لامل پخش می شود. ۵دقیقه فرصت می دهیم تا تمامی سلول های سوسپانسیون در یک سطح قرار بگیرند. عمل پر کردن چمبر بایستی یکباره و در یک نوبت صورت بگیرد. از پر کردن بیش از اندازه محفظه شمارش و همچنین ایجاد حباب جلوگیری شود.
برای شمارش از مربع وسط که بهترین انتشار سلولی را دارد، استفاده می کنیم. نحوه شمارش نیز به این صورت است که در مربع وسط، سلول های موجود در چهار مربع کناری و همچنین مربع مرکزی را شمارش کرده که در واقع یک پنجم کل مساحت مربع وسط را شامل می شود (۸۰ مربع از ۴۰۰ مربع).
بنابراین نتیجه حاصله را در عدد ۵ ضرب کرده و به عنوان شمارش سلول های یک مربع ۱×۱×۰/۱ mm3 در نظر می گیریم. با دخالت دادن میزان رقت سوسپانیون (۲۰۰/۱) و همچنین عمق محفظه شمارش (mm 0.1) نتیجه نهایی از طریق زیر محاسبه خواهد شد:
فاکتور رقت × فاکتور عمق ×۵ × تعداد سلول های ۵ مربع وسط = تعداد RBC در هر میکرولیتر
معمولاً فاکتور رقت و فاکتور عمق برای همه یکسان بوده و بنابراین می توان فرمول فوق را در نهایت به این شکل ساده نمود:
RBCs/µL = N×۱۰۰۰۰
لازم به ذکر است که در افراد آنمیک، از رقت ۱۰۰/۱ برای شمارش گلبول های قرمز استفاده می شود.
منابع خطا
خطاها ممکن است بخاطر ماهیت نمونه، تکنیک فرد انجام دهنده و تجهیزات غیردقیق باشد. خطاهای مربوط به توزیع سلول ها در هموسیتومتر، خطاهای میدان (Field errors) نامیدهمی شوند که با شمارش تعداد سلول های بیشتر، میتوان این نوع خطا را کاهش داد.
- خطاهای ناشی از ماهیت نمونه: وجود لخته های ریز در نمونه، بخاطر تغییراتی که در توزیع سلول ها یا کاهش تعداد آنها ایجاد می کند، سبب خطامی شوند. همچنین مخلوط نکردن کافی خون پیش از تهیه رقت و همچنین پس از تهیه رقت با مارکانو موجب خطا شده که میان آن به درجه رسوب سلول ها بستگی دارد.
- خطاهای ناشی از فرد انجام دهنده: شامل خطا در رقیق کردن، پر کردن محفظه شمارش و زمان شمارش می باشند.
- خطاهای مربوط به تجهیزات: استفاده از تجهیزات غیراستاندارد، هموسیتومتر خش دار و غیره.
- خطاهای ذاتی یا خطای میدانی: که ناشی از توزیع نامناسب سلول ها در مربع های شمارش هموسیتومتر است. همانگونه که قبلاً ذکر شد، با شمارش تعداد بیشتری سلول، میتوان این خطا را کاهش داد.
- لکوسیتوز شدید.
شمارش دستی گلبول های سفید
یکی دیگر از کاربردهای شمارش دستی سلول های خونی، شمارش گلوبول های سفید می باشد. در این جا برخلاف شمارش دستی گلبول های قرمز که از محلول های رقیق کننده استفاده می شده، به علت تعداد بسیار زیاد گلبول های قرمز در مقایسه با گلبول های سفید، از محلول های لیز کننده استفاده می کنیم. دو محلول عمده مورد استفاده عبارتند از:
| اسیداستیک گلاسیال | ۳ mL | محلول تورک |
| کریستال ویوله %۱ | ۱ mL | |
| آب مقطر | ۱۰۰ mL | |
| اسیداستیک گلاسیال | ۱۱ mL | محلول مارکانو |
| بلودومتیلن | ۵۰ mg | |
| آب مقطر | ۲۰۰ mL |
جدول سه: محلول های شمارش دستی سلول های خونی (گلبول های سفید)
این محلول ها باعث لیز گلبول های قرمز و رسوب لاشه سلولی آن ها در کنار پلاکت ها شده و در نتیجه یک سوسپانسیون خالص از گلبول های سفید ایجاد می شود. به این محلول ها، رنگ کریستال ویوله و یا بلودومتیلن نیز اضافه می شود تا دیدن هسته سلول ها آسان تر شود. کریستال ویوله باعث ایجاد رنگ آبی روشن در محلول شمارش می شود.
جهت شمارش گلبول های سفید، خون را تا خط ۰.۵ ملانژور سفید کشیده و محلول رقیق کننده را تا خط ۱۱ ملانژور پر می کنیم. رقت بدست آمده ۲۰/۱خواهد بود. در صورت لکوپنی از رقت ( ۱۰/۱ ملانژور سفید، خون تا خط ۱و محلول تا خط )۱۱ و در صورت لکوسیتوز از رقت ( ۱/۱۰۰ ملانژور قرمز، خون تا خط ۱ و محلول تا خط ۱۰۱) استفاده می کنیم.
پس از پر کردن محفظه شمارش لام نئوبار، عملیات شمارش را در چهار مربع بزرگ کناری آغاز می کنیم. فرمول نهایی محاسبه تعداد گلبول های سفید به صورت زیر خواهد بود:
فاکتور رقت (۲۰) × فاکتور عمق (۱۰) × میانگین سلول های شمارش شده = تعداد گلبول های سفید در هر میکرولیتر
به عبارت ساده تر:
۲۰۰ × میانگین شمارش شده = تعداد گلبول های سفید در هر میکرولیتر
و در صورتی که به جای میانگین، از مجموع شمارش سلول ها استفاده شود:
WBCs/µL = N × ۵۰
منابع خطا همانند شمارش دستی گلبول های قرمزمی باشد.
لازم به ذکر است که NRBCها با محلول مارکانو لیزنمی شوند و در هموسیتومتر با بزرگنمایی مربوط به شمارش لکوسیت ها، از WBCها قابل افتراق نیستند. بنابراین در هنگام شمارش افتراقی گلبول های سفید از روی گستره رنگآمیزی شده، میزان شمارش گلبول های سفید باید تصحیح شود:
شمارش دستی پلاکت ها
از روش های شمارش دستی سلول های خونی، شمارش پلاکت ها است. برای شمارش دستی پلاکت ها از محلول %۱ اگزالات آمونیوم (به محلول بریکر-کرانکیت نیز معروف است.) استفاده می شود (g 1.1 اگزالات آمونیوم در ۱۰۰ mL آب مقطر).
این محلول موجب تخریب گلبول های قرمز و سفید شده و در صورت پایین بردن کندانسور میکروسکوپ، پلاکت های رقیق شده با اگزالات آمونیوم به صورت ذرات کوچک درخشان دیده خواهند شد. محلول اگزالات آمونیوم تکه های غشای گلبولی را از بین نمی برد و ممکن است این لاشه های سلولی در زیر میکروسکوپ با پلاکت اشتباه شوند.
از آنجایی که پلاکت ها ساختاری گرانولار، درخشش ارغوانی و ظاهری گرد تا دندریتیک دارند، بنابراین با کمی مهارت می توان آن ها را از لاشه های سلولی تفکیک داد.
محلول اگزالات آمونیوم به مدت طولانی پایدار نبوده و در صورت نگهداری طولانی مدت، احتمال آلوده شدن آن با ذرات گرد و غبار و باکتری نیز وجود دارد. بنابراین در هر نوبت، بایستی به میزان مصرف چند روزه ساخته شود تا این محلول همواره تازه ساخت باشد.
باکتری ها به راحتی قادر به رشد در درون محلول اگزالات آمونیوم بوده و جالب اینکه همانند پلاکت ها درخشش دارند. از این رو بعد از تهیه محلول رقیق کننده، آن را با میکروفیلترهای مخصوص µ ۰.۲۲ پالایش نموده و در ۴ درجه نگهداری می کنیم. این فیلترها با حذف تمامی باکتری ها و گرد و غبار، حتی باعث استریلیزاسیون میکروبی محلول اگزالات نیز می شوند.
نحوه شمارش
همانند RBC، از ملانژور قرمز برای رقیق سازی و شمارش پلاکت استفاده می کنیم. خون را تا درجه ۱ و محلول اگزالات آمونیوم را تا درجه ۱۰۱ ملانژور پر می کنیم. رقت بدست آمده ۱۰۰/۱ خواهد بود. پس از پر کردن محفظه شمارش، لام نئوبار را به مدت ۲۰-۱۵ دقیقه در مکانی ساکن قرار می دهیم تا پلاکت ها در چامبر بالا آمده و با اتصال به سطح تحتانی لامل سنگی، همگی در یک سطح قرار بگیرند.
از آنجایی که این فرآیند طولانی بوده و ممکن است سوسپانسیون بین لام و لامل تبخیر شود، لام نئوبار را در یک پتری دیش حاوی پنبه مرطوب قرار می دهند تا شرایط تبخیر به حداقل خود برسد. همانند شمارش گلبول های قرمز، شمارش پلاکت نیز در ۵ مربع از مربع بزرگ میانی لام نئوبار صورت می گیرد (چهار مربع کوچک کناری و مربع مرکزی). سپس:
فاکتور رقت (۱۰۰) × فاکتور عمق (۱۰) × ۵ مجموع پلاکت شمارش شده = تعداد پلاکت در هر میکرولیتر
و بطور خلاصه:
Platelet/µL = N×۵۰۰۰
در برخی از کتب مرجع، شمارش پلاکت در دو طرف لام نئوبار و در مجموع در ۱۰ مربع توصیه می شود که در این صورت میزان شمارش شده را بایستی در عدد ۲۵۰۰ ضرب نمود. در صورتی که تعداد پلاکت ها در کل مربع بزرگ مرکزی شمارش شود، تعداد شمارش شده را در عدد ۱۰۰۰ ضرب خواهیم کرد.
برای حذف خطای میدان، شمارش حداقل ۱۰۰ پلاکت الزامیمی باشد. چنانچه تعداد شمارش شده کمتر از ۱۰۰ عدد باشد، مربع های بیشتری باید شمارش شوند، برای مثال ۲۵ خانه کوچک در یک طرف یا دو طرف چامبر. چنانچه باز هم تعداد شمارش شده در ۵۰ مربع، کمتر از ۱۰۰ باشد، نمونه ۱۰/۱ یا ۲۰/۱ رقیق می شود.
مقدار CV برای مجموع خطاهای میدان، پیپتینگ و خطای چامبر، برای شمارش حداقل ۱۰۰ پلاکت، ۱۱%می باشد.
تخمین شمارش سلول ها از روی گستره خون محیطی
برای تخمین شمارش گلبول های سفید و پلاکت ها از روی لام، به گستره ای با پخش منظم سلول ها در خون EDTA دار نیاز است.
برای شمارش تقریبی پلاکت، ۱۰ میدان با عدسی ۱۰۰ (Oil immersion) در مناطقی که پخش یکنواخت گلبول قرمز وجود دارد، انتخاب کرده و پلاکت های هر میدان را شمرده و میانگین بدست آمده را در عدد ۲۰۰۰۰ ضربمی کنیم.
انتخاب میدان ها براساس شمارش گلبول قرمز بیمار صورت می گیرد. بطور مثال اگر شمارش گلبول قرمز بیمار ۶ میلیون در میلیمتر مکعب باشد، شمارش پلاکتی در میدان های ۳۰۰ تایی و اگر ۵ میلیون باشد، در میدان های ۲۵۰ تایی و اگر ۴ میلیون باشد، در میدان های ۲۰۰ تایی صورت می گیرد تا ضریب ۲۰۰۰۰ تعداد را در میلیمتر مکعب محاسبه کند.
برای تخمین شمارش گلبول های سفید، میانگین شمارش گلبول های سفید در ۱۰ میدان با عدسی ۴۰ که در آن پخش یکنواخت گلبول های قرمز وجود دارد، را محاسبه کرده و حاصل در عدد ۲۰۰۰-۱۵۰۰ ضرب می شود.