شناسايي و تشخيص انگلهاي خوني از وظايف مهم آزمايشگاهها به شمار ميآيد .در اين ميان تشخيص مالاريا به علت شيوع بيشتر در ايران وهمچنين ايجاد عوارض شديد و گاهاً مرگ، در صورت عدم تشخيص و درمان به موقع، از اهميت بسزايی برخوردارمی باشد.
اگر چه بيماری در نواحی شرقی وجنوب شرقی ايران خصوصا در مناطق غير شهری شيوع بيشتری دارد ولی كليه آزمايشگاهها ميبايست در هر زمان آمادگي پذيرش و تشخيص نمونه مشكوك به اين بيماري را داشته باشند.
با وجود پيشرفت آزمايشات تشخيصي و حتی دستيابی به روشهای دقيق جهت شناسايی آنتی ژن انگلها، كماكان روش تشخيصی قطعی بسياری از انگلهای خونی از جمله پلاسموديومها مشاهده آنها در گسترش خونی می باشد . از آزمايشاتي نظير يافتن آنتيباديهاي ضد انگل مالاريا نيز می توان در برنامههاي غربالگري و يا شناسايي خونهاي آلوده در دهندگان خون استفاده نمود. تهيه گسترشهای خونی در بيماري های بابزيازيس، مرحله حاد شاگاس، تريپانوزومياز آفريقايی وبعضی ازانواع فيلاريازيس نيز قدم اوليه ومهم جهت تشخيص می باشد.
بنابراين با توجه به اهميت تشخيصی گسترشهاي خونی، كليه كاركنان آزمايشگاهها ميبايست از روشهاي صحيح جمع آوری نمونه و تهيه گسترشهاي خوني، تهيه رنگ و بافرهاي لازم، رنگآميزي مناسب و در نهايت ويژگيهاي مرفولوژيكي انگلها آگاه باشند.
- جمعآوري نمونه خون
اگر چه به محض شک به مالاريا در هر زمان جمع آوری نمونه الزامی است ولی رعايت زمان خونگيري ، شناسايی گونه و مرحله زندگی انگل را امکانپذيرتر می سازد. بهترين زمان خونگيري در فواصل بين حملات لرز و قبل از شروع تب ميباشد و معمولابدليل عدم امكان يافتن انگل در يك نوبت خونگيري، جمعآوري خون و تهيه گسترش می بايست تا سه روز متوالي هر 6-8 ساعت ادامه يابد. بديهي است كه تهيه نمونه قبل از استفاده از هرگونه داروي ضد مالاريا دارای ارزش تشخيصی می باشد.
تهيه نمونه خون از طريق خونگيري مويرگي و وريدي امكانپذيرمی باشد، ولی استفاده از خون مويرگی ارجح است، زيرا مواد ضد انعقاد موجب تغييرات مرفولوژيكي در انگل شده بنا بر اين استفاده ازخون وريدی محدود به شرايطي است كه تهيه گسترشهاي مناسب با استفاده از خون مويرگي مسير نباشد.در اينگونه موارد استفاده ازضد انعقادEDTA با رعايت نسبت دقيق با خون توصيه می گردد. در صورت عدم رعايت اين نسبت امكان شسته شدن گسترش ضخيم از روي اسلايد هنگام رنگآميزي و يا عدم رنگپذيري مناسب انگل وجود دارد. در هر حال در موارد خونگيري وريدي بهتر است تهيه گسترش از خون داخل سرنگ و قبل از مخلوط شدن با ماده ضد انعقاد و در صورت عدم امكان حداكثر 1 ساعت پس از نمونهگيري صورت گيرد. با گذشت يك ساعت از زمان نمونه گيری، تغييرات مرفولوژيکی در ساختمان انگل ايجاد شده و حالت منقوط شدن گلبولهاي قرمز نيز از بين ميرود ولی شكل كلي انگل حداكثر تا دو ساعت قابل تشخيص باقي ميماند.
- تهيه گسترش های خونی
جهت تشخيص انگل از گسترش های ضخيم و نازک استفاده شده و طبق توصيه CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) در زمان پذيرش بيمار تهيه حداقل 4 گسترش خوني شامل دو گسترش ضخيم و دو گسترش نازك ضروری می باشد.
گسترشهاي ضخيم امكان تشخيص عفونتهاي خفيف را فراهم ساخته و در واقع حجم زيادي از خون در زمان كمی بررسی می گردد، اگرچه تشخيص گونه پلاسموديوم در اين نوع گسترش ها به مهارت كافي نياز دارد.
با بررسي گسترشهاي خونی نازك امكان تشخيص مراحل مختلف زندگي انگل و افتراق گونههاي مختلف فراهم می گردد.
طرز تهيه گسترش های خونی نازك همانند تهيه گسترشهاي خوني معمول بوده که در آزمايشگاهها به منظور بررسی سلولهای خونی انجام می گردد. يك گسترش نازك مناسب ميبايست در ناحيه مركزي اسلايد واقع شده ،حاشيههاي كناري آن آزاد ، در يك انتها ضخيم و در
انتهاي ديگر نازك و طول قسمت نازك آن حداقل 2 سانتيمتر باشد . اين گسترشها در دماي اتاق خشك شده و پس از خشک شدن می بايست با متانول خالص ثابت گردند.
تهيه گسترشهای ضخيم بدو صورت امكانپذير ميباشد:
در روش اول ميتوان پس از تماس اسلايد با قطره خون حاصل از خونگيري مويرگي با چرخاندن اسلايد (يا با استفاده از انتهاي سواپ) خون را پخش كرده تا به قطر و ضخامت مناسب برسد(قطر سكه دو ريالي و ضخامتي كه نوشتههاي روزنامه از پشت آن براحتي قابل خواندن نباشد.) در صورت بزرگ نبودن قطره خون و يا لخته شدن آن استفاده از اين روش مناسب نميباشد.
در روش دوم چند قطره خون مويرگي يا وريدي بر روي اسلايد قرار داده و با انتهاي سواپ مخلوط و پخش شده تا به قطر و ضخامت مناسب برسد. با چرخاندن دورانی اسلايد به مدت30 ثانيه رشتههاي فيبرين ازبين رفته که اين امر خطاهايی مانند جدا شدن گسترش از اسلايد و يا محو شدن انگلها پس از رنگآميزي بدليل وجود رشته های فيبرين را به حد اقل می رساند.
گسترشهاي ضخيم ميبايست در سطح صاف افقي و دماي اتاق خشك شده ولی ثابت نگردند. در مناطق مرطوب ميتوان از انكوباتور Cْ25 برای خشک کردن گسترشها استفاده نمود ولي استفاده از دماي Cْ37 و يا حرارت بدليل ثابت شدن گلبولهاي قرمز و عدم ليز كامل آنها توصيه نميگردد. اين گسترشها در دماي اتاق در عرض 12-8 ساعت خشك ميشوند ولي با استفاده از پنكه ميتوان اين زمان را به حدود 4-1 ساعت تقليل داد. در موارد اضطراري جهت تشخيص سريع ميتوان گسترشها ضخيم را اندكي نازكتر از معمول تهيه نمود تا در عرض يكساعت خشك شوند.
در بعضي از آزمايشگاهها خون حاوي EDTA سانتريفوژ شده و پس از برداشتن پلاسما و بافي كوت ، از لايههاي فوقاني گلبولهاي قرمز و پلاسماي باقيمانده گسترش نازك تهيه ميگردد. اين روش باعث تغليظ انگلها و همچنين كاهش تعداد پلاكتها در گسترش می شود. کاهش پلاکتها امکان ايجاد خطاهای تشخيصیرا کاهش می دهد.گسترشهاي تهيه شده قبل از رنگآميزي ميبايست با متانول خالص ثابت شوند.
- رنگآميزي گسترشها ی خونی
گيمسا مناسبترين رنگ جهت رنگآميزي انگلهای خوني ميباشد و امكان تشخيص دانههاي شافنر،كه در بعضي از گونههاي پلاسموديوم ديده ميشود، را ميسر ميسازد. اين دانه ها در رنگآميزيهاي رايت يا رايت گيمسا بخوبي قابل تشخيص نميباشند. نکته مهم در تهيه رنگ، تنظيم PH بافر رقيقكننده( بافر فسفات) بوده که جهت تشخيص افتراقي انواع انگلهاي خوني ميبايست در حد 2/7-7 حفظ شود. از رنگ گيمسا با غلظتهاي مختلف ميتوان جهت رنگ آميزی گسترش ها متناسب با شرايط بيمار و به منظور تشخيص سريع استفاده نمود بطور مثال در موارد اضطراري استفاده از رنگ با غلظت 5/7% به مدت 15 دقيقه و در ساير موارد به منظور رنگآميزي بهتر ساختمانهاي داخلي انگل استفاده از غلظتهاي 5/2% به مدت 45 دقيقه و يا 2% به مدت 60 دقيقه توصيه می گردد. در پايان رنگ آميزی ، شستشوي اسلايدها با بافر دارای PH 2/7-7 كيفيت نهايی رنگ را بهتر مينمايد.
كنترل كيفي رنگ و بررسي كيفيت رنگ پذيري انگلها با استفاده از رنگآميزي گسترشهاي خوني معمولی امکانپذير می باشد که در صورت مناسب بودن رنگ پذيري گلبولهاي قرمز، سفيد و پلاكتها، می توان از رنگآميزي مناسب انگلها نيز مطمئن گرديد.
برای آگاهی از طرز تهيه رنگ و بافر رقيق کننده می توان از کتب مرجع يا دستورالعمل استاندارد CLSI(M15-A) استفاده نمود.
- بررسي گسترشهاي خونی تهيه شده
بطور كلي در بررسي گسترشهاي خوني جهت شناسايي و تشخيص انگلها ابتدا از درشتنمايي كم و متوسط (×10و ×40) ميكروسكوپ جهت يافتن اجزا درشتتر نظير شيزونت و گامتوسيت و نهايتاً از درشتنمايي زياد ×)100 )جهت بررسي كامل گسترش استفاده ميگردد. برای بررسي كامل گسترش می بايست حداقل 300 ميدان با درشتنمايی زياد ×)100 )مشاهده گردد.
تشخيص انگلهاي خوني، خصوصاً چهارگونه پلاسموديوم كه در انسان ايجاد عفونت نموده و همچنين افتراق صحيح آنها از هم جهت انتخاب درمان مناسب ضروري است. افتراق اين گونهها با استفاده از مشخصاتي نظير اندازه و شكل گلبولهاي قرمز آلوده، وجود يا عدم وجود
دانههاي شافنر، شكل و تعداد تروفوزوئيتها در داخل گلبول قرمز و شكل گامتوسيتها امكانپذير بوده که معمولاً تشخيص قطعي با استفاده از کنار هم قرار دادن چند يافته فوق امکانپذير می گردد.
نكته مهم در امر تشخيص، افتراق انگل از مواردي مانند پلاكت ، رسوب رنگ، قارچ و يا باكتريهايي است كه بر روي گلبول قرمز قرار گرفتهاند. افتراق پلاسموديوم فالسي پاروم از بابز يا نيز جهت انتخاب درمان مناسب، دارای اهميت بوده که اگرچه اين امر گاهاً در بررسي ميكروسكوپي به سختي صورت گرفته، بدليل عدم دسترسي تمامي آزمايشگاهها به آزمايشهای اختصاصي نظير تلقيح نمونه مشکوک به حيوانات آزمايشگاهي، آزمايشات سرولوژي و يا PCR كماكان تشخيص افتراقي ميكروسكوپي از اهميت ويژهاي برخوردار ميباشد.
- تعيين ميزان پارازيتمي
تعيين ميزان پارازيتمي قبل از شروع درمان و جهت پيگيري اثر دارو بر روي عفونت و تعيين سوشهاي مقاوم به داروي پلاسموديوم فالسي پاروم ضروري ميباشد که بطور معمول قبل از درمان و 24، 48 و 72 ساعت پس از درمان انجام ميگيرد. در صورت موفقيت درمان ميزان پارازيتمي در عرض 24 ساعت اول درمان بطور مشخص كاهش مييابد. ( تا 50% يا بيشتر )
تعيين ميزان پارازيتمي به دو روش امکانپذير می باشد.در روش اول که فقط در گسترشهاي نازك قابل انجام بوده با حداقل مشاهده 10 ميدان ميكروسكوپي درصد گلبولهاي قرمز آلوده به ازاي شمارش100 گلبول قرمز گزارش ميگردد. (مثلاً 05/0% يا 1%)
در مواردي که تعداد انگلها در خون كم است می توان از روش ديگری استفاده نمود که بر روی هر دو گسترش ضخيم و نازك قابل انجام است .در اين روش تعداد انگل برحسب شمارش 100 گلبول سفيد اعلام ميگردد .همچنين ميتوان مقدار انگل را در يك ميكروليتر خون نيز محاسبه نمود که براي اينكار تعداد انگل شمرده شده بر حسب 100 گلبول سفيد در تعداد كل گلبولهاي سفيد خون ضرب شده و نتيجه بر عدد 100 تقسيم ميگردد. قابل ذکر است که در صورت كم بودن تعداد انگلها ميتوان تعداد آنها را به ازاي 200 گلبول سفيد شمارش نمود.